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流式细胞分选仪

MoFloAstrios预约使用说明

 

一.预约与收费规则

1.仪器使用时间:工作日 10:00-16:30;(9:00-10:00为机器启动及光路校正时间,16:30后为仪器管路清洗消毒时间);

2.微澜系统仅供查看仪器预约安排。预约请直接联系宫佳杰进行人工确认。

3.使用仪器前请至少提前一周向仪器负责人预约,并告知仪器负责人具体实验内容,仪器负责人根据仪器使用情况安排上机时间,如取消预约须至少提前一天告知仪器负责人,否则一律按照2小时收费;

(仪器负责人:宫佳杰   联系电话:021-68582267 邮箱:13795305811@163.com)

3.收费标准:

院内:前2小时内400元,后续每小时按100元/小时计算;

院外:前2小时内1400元,后续每小时按200元/小时计算。

二.样品制备要求

1.上样前请针对不同的细胞样本进行相应处理,减少细胞粘连,使细胞形成单细胞悬液;

1.1.贴壁细胞消化后可用含2%FBS的PBS或无酚红RPMI-1640培养基重悬,禁止使用高糖培养基,以减少自发荧光干扰;

1.2.组织消化后因有许多DNA从死细胞中泄露,导致细胞粘连,请在消化液中加入DNaseI 25ug/ml+5mM MgCl2,并在后续抗体染色中往staining buffer中添加DNaseI25ug/ml+5mM MgCl2

2.细胞活力会直接影响分选后的细胞活性,同时死细胞会有较强的自发荧光干扰分选,因此必需用PI或7AAD染料区分死细胞,染色五分钟,离心2次,洗去染料,才能做后期荧光分选;

3.为保证分选效率,建议上样细胞浓度不低于1×107/ml;

4.为保证细胞活性,请将样品置于冰上;

5.实验对照设计:

5.1.转染荧光蛋白的细胞样品,需提供为转染的细胞样品以供校正

5.2.多种荧光抗体标记的样品,需要提供(a) 为染色的细胞样品   (b)每一种荧光抗体单独染色的样品,以供仪器校正和荧光补偿。

6.预实验设计:

6.1.荧光蛋白标记的细胞系可直接上机分选,不需要预实验;

6.2.从组织中分离的细胞尤其是含量稀少的细胞,请先做小规模的预实验,以测定细胞含量以及优化分选策略;

7.所有样品在上机前必须转移至带滤网的FACS管内上样(由Hu Lab提供,FALCON,货号:352235);

三.样品收集

1.活细胞收集:收集样品可选用不同规格离心管(5ml、15ml、50ml)和细胞培养板,请在分选前往离心管中加入1-2ml含有20%FBS的培养基,培养板中加入覆盖底面积的量;

2.DNA分离:收集管中提前加入PCR mix或lysis buffer;

3.RNA分离:收集管中提前加入Trizol或RLT buffer;

四.荧光素选择

    实验采用多种荧光染色标记时,请用以下工具仔细对比,防止荧光发射光谱重叠,导致实验失败。

荧光光谱查看器:

http://www.bdbiosciences.com/cn/s/spectrumviewer

https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html


 

 五:MoFlo荧光通道信息:

激光器

带通滤片

常见染料

 

355

448/59

DAPI,  Hoechst

620/29

PI

692/75

BUV661

405

448/59

DAPI,  CFP,  Alexa 405,  eFluor 450

546/20

eFluor 506

 

 

 

488

513/26

EGFP,  FITC,  YFP,  Alexa 488,  Calcein AM

576/21

PE/R-PE

620/29

PI,  PE-CF594,  EB

664/22

PerCP,  PE-Cy5,  PE-Cy5.5,  7-AAD

710/45

PerCP-Cy5.5,  PerCP-eFluor 710

795/70

PE-Cy7

561

579/16

Cy3,  DsRed,  tdTomato,  PE,  Rhodamine Red

614/20

mCherry, PI

692/75

PE-Cy5,  PE-Cy5.5,  7-AAD

640

671/30

APC,  Cy5,  Alexa 647

722/44

Alexa 700

795/70

APC-Cy7


 

 

 











样品种类

细胞浓度

荧光标记

目的细胞群体

示例-1 HEK293T

 

1×107/ml

 

GFP,PI

 

GFP

示例-2

小鼠大脑消化细胞

 

2×107/ml

GFP-Alex488

PI

CD31-Alexa647

CD146-PE-Cy7

CD31-ALexa647+CD146-PE-Cy7

双阳性

六.样品信息表(上表)

分选实验室,请按照一下表格提供样品信息,以供分选是快速设定正确的荧光通道。

 


七.细胞分选所需时间参考 

Frequency of cells of

10%

     1.0%

0.1%

interest

 

 

 

Starting number of

1x107

1x108

1x109

cells required

Time to sort 1x106

30

300 (5 hours)

3000 (50 hours)

cells (minutes)


 


 

 




八.数据备份及分析

    请自备空白光盘一张,用于拷贝实验数据,拷贝后请妥善保存实验数据。平台不承担任何因违反本

规定而导致的实验数据丢失、外泄等。严禁用U盘,擅自使用U盘者,将被禁用仪器3-6个月或取消仪器使用资格。

数据分析软件:Beckman Summit(可从Hu Lab拷贝)。

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